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數(shù)字PCR實驗技巧攻略

更新時間:2021-09-22

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  數(shù)字PCR(DigitalPCR)技術作為新一代核酸檢測和定量技術,目前在痕量核酸樣本檢測、復雜樣本稀有突變檢測和微小表達差異鑒定等方面表現(xiàn)出的優(yōu)勢已被普遍認可。NGS和CRISPR等分子生物學技術的發(fā)展,為數(shù)字PCR技術在microRNA研究、基因組拷貝數(shù)鑒定、致病微生物鑒定、轉(zhuǎn)基因成分鑒定及基因細胞治療等諸多領域帶來了新的契機。基于這一功能強大的新技術,如何獲得更理想的實驗結(jié)果呢?下面且聽小Q娓娓道來。
  引物優(yōu)化設計
  良好的引物探針設計是數(shù)字PCR實驗獲得成功的關鍵因素之一。這正是眾多研究人員選擇LNA(鎖核酸技術)的原因——LNA修飾的引物和探針采用了成熟可靠的算法設計,獲得了科學家的信賴。
  使用不合適的引物可能會引入引物二聚體、非特異性擴增等,進而影響實驗結(jié)果的準確性。在此,小Q建議您在設計引物時需做以下幾個方面的檢查,需對設計好的引物進行BLAST比對分析,以確保引物的特異性!
  在數(shù)字PCR定量實驗中,對于基因突變檢測、基因表達差異分析和拷貝數(shù)變異鑒定等對實驗性要求較高的實驗,需要特異性更高的Assay。QIAGEN基于QIAcuity數(shù)字PCR平臺開發(fā)并驗證了針對上述常見應用的700多組dPCRLNAAssay,所有Assay均經(jīng)過鎖核酸修飾來增強其對互補序列的親和力和特異性,進而提高實驗結(jié)果的準確性。
  鎖核酸技術優(yōu)勢
  樣品制備
  值得注意的是,在gDNA長度≥20kb或進行拷貝數(shù)變異檢測實驗時,必須對樣品進行酶切處理,確保大片段DNA序列或串聯(lián)序列在酶切處理后,模板隨機且均勻的進入獨立反應體系,以實現(xiàn)準確和精確的定量。
  建議酶切位點
  數(shù)字PCR實驗離不開包含有Mg2+、dNTP、Buffer和DNA聚合酶等PCR反應所需要的MasterMix。隨著實驗的不斷深入,對于實驗條件的要求也不斷提高,其中DNA聚合酶對實驗的準確性起著至關重要的作用。由于非熱啟動的DNA聚合酶在反應體系易使引物在室溫條件下發(fā)生非特異性擴增,直接影響實驗結(jié)果。為確保實驗順利進行,QIAcuityEGPCRKit和ProbePCRKit均采用抗體修飾的熱啟動DNA聚合酶,利用小分子鎖扣(Guardmolecular)將DNA聚合酶與抗體緊密結(jié)合形成雙保險,使其室溫條件下失活,只有通過95℃高溫2分鐘才能開啟小分子鎖扣,激活DNA聚合酶活性,有效避免了非特異性擴增現(xiàn)象。
  熱啟動DNA聚合酶技術
  樣品分區(qū)微反應單元體積大小一致且穩(wěn)定是泊松分布準確計算的前提。樣本反應液在進行液滴分散過程中由于液體表面張力、操作不當?shù)扔绊?,導致其部分發(fā)生融合和破裂。融合使液滴體積變大,破裂則導致有效分區(qū)數(shù)量變少更增加了交叉污染的風險。因此,整個實驗過程需嚴格按照標準流程進行實驗操作。相較于液滴式分區(qū),QIAcuity數(shù)字PCR搭配的Nanoplate采用納米微孔設計,利用微流體技術將數(shù)字PCR反應體系分配到大小均一且固定微孔中,并在分區(qū)完成后自動封閉所有微孔聯(lián)通管道,真正意義上實現(xiàn)獨立均一的微反應體系。
  熱循環(huán)過程PCR擴增效率的高低直接影響終信號的判讀和實驗結(jié)果分析。在進行熱循環(huán)實驗時,需檢查樣品的密封性以及PCR反應板是否和PCR儀熱蓋*接觸,確保PCR過程中樣品反應液沒有蒸發(fā)。QIAcuity數(shù)字PCR系統(tǒng)采用獨立的微反應腔室封閉方式,固態(tài)的物理分割和封閉可有效避免PCR過程中微反應體系的水分蒸發(fā),確保微反應體系中樣本反應液濃度的恒定,更易實現(xiàn)準確和精確的定量。
  數(shù)據(jù)分析原始數(shù)據(jù)中往往發(fā)現(xiàn)陽性信號與陰性背景之間存在許多弱陽性信號。因此需要對引物探針進行重新設計和優(yōu)化(詳見引物探針優(yōu)化設計)或提升退火溫度(探針通常比引物高5~10℃),以消除疑似熒光信號的“雨區(qū)“現(xiàn)象;此外,陽性信號和陰性背景間隙過小,導致終結(jié)果無法準確判讀。因此需要調(diào)整引物探針濃度(建議總反應體系引物濃度為600~800nM;探針濃度為200-400nM)或5'端前三個堿基如有G出現(xiàn),則將其互補序列設計為實驗所用探針,以提高陰陽性信號間隙,便于分析結(jié)果的準確判讀。
  
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